Small RNA测序

产?#26041;?#32461;

small RNA测序是生命活动重要的调控因子,在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。Illumina能够对细胞或者组织中的全部Small RNA进行深度测序及定量分析等研究。

miRNA鉴定

miRNA转?#35745;?#22987;位点多位于基因间隔区、内含子以及编码序列的反向互补序列上,其前体具有标志性的发夹结构,成熟体的形成是由Dicer/DCL酶的剪切实现的。对于已知miRNA的鉴定,我们将比对上参考基因组的reads序列与已知miRNA数据库miRBase(v21)中的成熟miRNA序列进行比对。针对miRNA的生物特征,对于未鉴定到已知miRNA的序?#26657;?#30334;迈客利用miRDeep2软件进行新miRNA的预测。

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基因表达水平分析

利用转录组数据检测基因表达具有较高的灵敏度。通过FPKM密度图和箱线图不仅可以?#20174;?#21333;个样品基因表达水平?#26893;?#21644;离散程度,还可以直观的比较不同样品的整体基因表达水平差异。

差异表达miRNA聚类分析

聚类分析用于判断差异基因在不同实验条件下的表达模式,可通过将表达模式相同或相近的基因聚集成类,从而识别未知基因的功能或已知基因的未知功能,同类基因可能具有相似的功能或共同参与同一代谢过程。对筛选出的差异表达miRNA做层次聚类分析,将具有相同或相似表达行为的miRNA进行聚类。

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差异miRNA靶基因注释

生物体内,在特定条件下某些基因对应的转录本会形成miRNA前体,失去编码功能,从而影响生物学表型。因此,针对miRNA的靶基因分别进行GO和KEGG注?#22270;案?#38598;分析,有助于深入挖掘小RNA功能。

Q1. 动植物在miRNA预测中有什么差别:

答:植物miRNA可与mRNA的编码区完全互补配对,并通过诱导mRNA降解而发挥抑制表达的作用,我们可以直接通过比对来筛选靶基因
动物miRNA则可与mRNA的3’UTR区部分互补配对结合,进而抑?#21697;?#35793;的进?#26657;?#19968;般的,miRNA与mRNA的配对区域位于miRNA的5’端的 2-8个碱基,称为种子区,只要种子区能与mRNA互补配对即可发挥作用,这也是一个miNRA能够调控数百条mRNA的原因。
①对于动物预测靶基因我们不是直接通过比对进行筛选的。
②在动物预测?#20445;?#30001;于我们没法给出3‘utr区,因此我们截取mRNA5’端前2000bp使用动物预测靶基因方法进?#24615;?#27979;,target_length指的就是我们截取该基因的长度。

Q2. 分析结果中如何确定miRNA对应的pre-miRNA的数量(别人论文中有这样的结论:We identified 83 potential novel miRNAs, which corresponded to 95 genomic loci.)?

答:文献中的描述是指某些成熟的miRNA序列可能来自于不同的miRNA前体序?#26657;?#26080;参项目中分析的novel miRNA是针对每个Unigene分析的,命名也是与Unigene对应,没有对成熟miRNA的序列进行重复的分析。对成熟的miRNA的序列进行去重复统计,例如某项目预测出了229个miRNA,其中有6个miRNA分别来自于两个不同的前体序?#26657;?#25925;可表述为:预测出了223个miRNA,对应了229个前体序?#23567;?/p>

Q3. 目前对于小RNA靶基因的结果验证方法有哪些?

答:

  1. RT-PCR对miRNA进行定量验证;
  2. miRNA过表达;
  3. 荧光素酶法,过表达miRNA测定靶基因表达量;把靶基因连上一个荧光素酶,如果靶基因表达量下降,可检测到的荧光信号则减弱
  4. 降解组测序
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